細(xì)胞凍存的操作步驟及注意事項(xiàng)

細(xì)胞凍存是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)重要技術(shù)，它允許研究者在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。以下是細(xì)胞凍存的操作步驟及注意事項(xiàng)：

操作步驟

一、細(xì)胞準(zhǔn)備

細(xì)胞收集與計(jì)數(shù)：

將細(xì)胞在培養(yǎng)液中離心，通常是在1000rpm（或250g）左右離心3至5分鐘。

棄去上清液，根據(jù)需要重新懸浮細(xì)胞。

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板來計(jì)算細(xì)胞密度，確保細(xì)胞密度達(dá)到凍存要求（如≥90%匯合度或細(xì)胞計(jì)數(shù)在特定范圍內(nèi)）。

細(xì)胞消化：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，用PBS潤(rùn)洗后，加入胰酶進(jìn)行消化，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型決定。

消化完成后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打均勻制備成細(xì)胞懸液。

二、凍存液制備

配置凍存液：

凍存液通常為含有細(xì)胞保護(hù)劑（如二甲基亞砜DMSO，通常濃度為10%）的完全培養(yǎng)基。

配置完成后，嚴(yán)格避光保存。

三、細(xì)胞混合與分裝

細(xì)胞混合：

將細(xì)胞懸浮液與凍存液混合，使每個(gè)凍存管中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到推薦范圍（如1~5×10^6個(gè)細(xì)胞/管）。

快速但輕柔地混合細(xì)胞和凍存液，避免DMSO對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

分裝與標(biāo)記：

將混合好的細(xì)胞分裝入無菌凍存管中。

封閉并標(biāo)記凍存管，記錄細(xì)胞類型、代數(shù)、數(shù)量、凍存日期、操作者姓名等信息。

四、冷凍與儲(chǔ)存

冷凍過程：

使用凍存箱或程序冷凍箱緩慢冷凍細(xì)胞。常用的方法是每小時(shí)降溫-1°C至-80°C，或者將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，再放入-80°C冰箱過夜。

若沒有程序降溫盒，則按室溫→4°C 20分鐘→-20°C 30分鐘→-80°C過夜→液氮保存的順序依次降溫。

長(zhǎng)期儲(chǔ)存：

將細(xì)胞在-80°C冷凍器中放置足夠時(shí)間（如過夜）后，轉(zhuǎn)移到液氮罐中進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。液氮罐的溫度通常在-196°C左右，適合長(zhǎng)期保存活細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

細(xì)胞狀態(tài)：

應(yīng)選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)、細(xì)胞匯合度80%~90%左右的細(xì)胞進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)**。

凍存前注意切勿消化時(shí)間過長(zhǎng)、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)，以免造成細(xì)胞損傷。

凍存液配置：

凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細(xì)胞懸液中。

配置完成后，嚴(yán)格避光保存。

凍存管選擇：

使用高質(zhì)量的凍存管，避免在極低溫度下破裂或泄漏。

溫度控制：

控制冷凍速度至關(guān)重要。如果冷凍過快，細(xì)胞內(nèi)部可能形成大量小冰晶，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；如果冷凍過慢，細(xì)胞外的大冰晶形成可能導(dǎo)致細(xì)胞脫水和損傷。

凍存細(xì)胞長(zhǎng)期保存應(yīng)放置于液氮，不建議在-80°C長(zhǎng)期保存。

標(biāo)記與記錄：

適當(dāng)?shù)臉?biāo)記和記錄是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。確保凍存管上的信息準(zhǔn)確無誤，以便后續(xù)使用。

定期檢查：

細(xì)胞凍存后定期檢查存活率及細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞質(zhì)量。

綜上所述，細(xì)胞凍存需要遵循一系列操作步驟和注意事項(xiàng)，以確保細(xì)胞的存活率和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。